Jdi na obsah Jdi na menu
 


3.4.Izolace DNA

 

DNA  byla připravována  standardně a  výhradně pomocí  komerčních izolačních  setů firmy  QIAGEN a BOEHRING MANNHEIM, souprav  pro izolaci  DNA z  tkání QIAamp  DNA  Mini  Kit  QIAGEN  (katalog č.51308),  a High  Pure PCR  Template Preparation  Kit BOEHRINGER MANNHEIM (katalog 1796828), protokoly pro izolaci DNA z tkání.

 

Obrazek

Souprava na přípravu DNA

 

Postup:  

 

 

 

k  0,2-0,5  g  tkáně  bylo  přidáno 180 ul lytického pufru ATL (4M  urea,100mM Tris,200mM EDTA) a 20  ul roztoku s 0,8 mg  Proteinázy K.  Při 56  C bylo  tráveno 4  hodiny, následně 18 hodin  při  37  C.  Poté  bylo   přidáno  180  ul  AL  pufru  (6M quanidin-HCl,10mM  urea,10 mM  Tris-HCl,20% Triton  X-100) a  pro promíchání inkubování 10 minut při 70 C. Poté bylo přidáno 210 ul 99% ethanolu,  vortexováno 30 vteřin.Obsah  přemístěn do izolační kolonky s  adsorbční    vrstvou  a inkubováno 1 minutu. Stočeno při 8000  ot/min.,dvakrát promyto 500 ul slaného alkoholu  (20 mM NaCL a 2mM Tris-HCL v ethanolu)  centrifugací 1 minutu při 8000 a 13000 ot/min. Absorbovaná DNA se vymyje 2 x 200 ul elučního pufru AE (10  mM Tris pH 8,5)  při teplotě 70 C  centrifugací po dobu 1 minuty  při 8000  otáčkách. Roztok  DNA je  stabilní při  teplotě kolem  4 C,  archivovatelný po  řadu  let  při -20 C (- 80C) bez častého rozmrazování. Je přímo použitelný pro PCR reakční směs. Výtěžek  izolace je  z cca  0,2 g  tkáně kolem  50 ug  nukleových kyselin při čistotě s indexem kolem 1.9  DNA poměru absorbance A 260/A280 nm (poměru absorbace nukleových kyselin a bílkovin ve vzorku).

 

 

 

3.5.Materiál a metoda PCR

 

 

 

3.5.1.Úvod

 

Polymerázová  řeťezová reakce  PCR (Polymerase  chain reaction) jemoderní metoda velmi účinného zmnožení a detekce specifické DNA vypracovaná  v  roce  1983  v  laboratořích  Cetus  Corporation v Kalifornii,prezentovaná veřejně od roku  1984 K.B.Mullisem a od téhož roku také patentovaná.(Mullis,K.B.,Faloona,E.A.1996,14) K požitelné účinné  detekci hledané specifické DNA  je třeba mimozákladních  složek  pro  syntézu  DNA  (nukleotidy,Mg inoty,enzym polymerázu a  pufrovací systém) malé množství  předlohy - primeru vybrané  originální  sekvence  specifické   pro  ten  který  druh nositele  DNA.  Při  použití  vhodného  tepelného  profilu  rakce mnohokrát opakované dojde k produkci tak velkého množství pomnožené části originální DNA, že je ji možné po separaci elektroforézou znázornit,   porovnáním  s   velikostním  markrem   a  pozitivním kontrolou   identifikovat,   případně  kvantifikovat.  Negativní kontroly přípravy a amplifikace složek reakce bez specifické DNA

a kontroly  s  nespecifickou   DNA,  potvrdí  věrohodnost  nálezu. Případná   následná   hybridizace nebo sekvenace  produktu   PCR potvrdí  též náležitost amplifikátu k DNA hledaného agens. 

 

Obrazek

Příprava mixů se vzorky

 

3.5.2.Reakční směs

 

Pro  vyšetřování byly  použity komerční  reakční směsi tzv.master mixy  od firem  QIAGEN a  ROCHE. Pro  PCR s  horkým startem,který zabraňuje vzniku nespecifických produktů byl použit HotStarTaq Master Mix Kit QIAGEN (katalog č.203445) a pro stadardní postup PCR  Master   ROCHE  (katalog  č.1   636  103).

Mixy  ve   finální koncentraci  obsahují v 100  ul: 2,5 jednotek Taq DNA polymerásy 10mM Tris-HCl,50mM KCl,1,5mM MgCl2 0,005% Brij 35 ICI,nukleotidy dATP,dCTP,dGTP,dTTP  všechny v  koncentraci po  0,2 mM.Hodnota pH mixu je 8,3. Master mix pro  horký start  firmy QIAGEN  obsahuje HotStar  Taq Polymerázu,která se aktivuje zahřátím na 95 C po dobu 15  minut,navíc  obsahuje   (NH4)2SO4.Další  podrobnosti  výrobce neuvádí.

 

Předpis  na  100  ul  PCR  mixu  při  použití  komerčních mixů 2x koncentrovaných:

 

 

 

 

 

 

 

3.5.2.Vybrané identifikační primery

 

 

 

Uvedené  primery  pro  identifikaci  jednotlivých agens rutinně používá   Národní  laboratoř  pro   lymeskou  borreliózu Státního zdravotního ústavu v Praze.

 

Přehled primerů používaných k identifikaci izolované DNA

 

 

 

zkratka:  sekvence:            pro identifikaci druhu:

 

                            původ z genu: velikost produktu:

 

anil.teplota, koncentrace iontů Mg,koncentrace primeru,citace

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

 

1.*bb´

 

  b  5-GAT AAA AAC GAA GAT AAT CG-3  Borr.burgdorferi (evrop.druhy)

 

  b´ 5-ACT AGG ATC TGT GGA TAT TC-3           produkt: 356 bp

 

  an.teplota:   37   C,   1,5   mM   MgCl2   ,   konc.   0,3   uM

 

  (ROSA,P.A.,1991,15)

 

2.**cc´

 

   c 5-CCA ACT TTA TCA AAT TCT GC-3  Borr.burgdorferi (všechny druhy)

 

   c´5-AGG ATC TAT TCC AAA ATC-3              produkt: 123 bp

 

   an.teplota:    37    C,(55*)     1,5mM    MgCl2,konc.0,3    uM

 

  (ROSA,P.A.,1991,15)

 

3. BGA 5-GGG ATG TAG CAA TAC ATC T-3     Borrelia garinii

 

   BGB 5-ATA TAG TTT CCA ACA TAG T-3   16SrRNA  produkt: 574 bp

 

   an.teplota: 47 C, 1,5 mM MgCl2,konc. 0,5uM   (MARCONI.,1992,16)

 

4. VSA 5-GCA TGC CAA GTC AAA CGG A-3     Borrelia afzelii

 

   VSB 5-ATA TAG TTT CCA ACA TAG C-3   16SrRNA produkt: 591 bp

 

   an.teplota: 47 C, 1,5 mM MgCl2,konc. 0,5uM  (ROSA,P.A.,1991,17)

 

5. ES1,2

 

   P15 5-AAA GCC TGA TCC AGC TAT GCC G-3  Ehrlichia speciés

 

   M7  5-CCG ACA ACG TAT TCA CCG TGG C-3 16SrRNA  produkt:  979 bp

 

   an.teplota:    60,5    C     2,5    mM    MgCl2,    konc.0,5uM

 

                         (PC/GENE ,Fidler,Z.,Hulinska D.,1976)

 

6. OSPA-L,R5

 

   L5 5-TGG ATC TGG AGT ACT TGA AGG CGT-3 Borrelia burgdorferi

 

   R5 5-AGT GCC TGA ATT CCA AGC TGC AGT-3    produkt: 448 bp

 

   an.teplota:  68  C,  2  mM  MgCl2,  konc  O,5uM

 

   (Manak,M.M  a kol.,1997,18)

 

 

 

7. EBV TC 67,69,BMRF1

 

   TC67 5-CAG GCT TCC CTG CAA TTT TAC AAG CGG-3 Epstein-Barr virus

 

   TC69 5-CCC AGA AGT ATA CGT GGT GAC GTA GA-3  BMRF1  produkt: 287 bp

 

   an.teplota: 58 C, 1,5 mM MgCl2,konc.0,25uM

 

                                       (Fiedler,Z.,Hulinska,D.,1976) 

 

8. CMV 028,029

 

   028  5-AAA GAG CCC GAC GTC TAC TAC ACG T-3   Cytomegalovirus

 

   029  5-CCA GGT ACA CCT TGA CGT ACT GGT C-3 pp65   produkt: 150 bp

 

   an.teplota: 55 C,1,5mM MgCl2, konc.0,5uM  (Yaia a kol.1990,19)

 

 

 

 *)primery použité při prvním amplifikačním kroku v nested PCR

 

**)primery použité jako vnitřní v druhém ampl.kroku v nested PCR

 

(Melchers,W.,a kol.,1991,20)

 

 

 

3.5.3.Teplotní profil PCR

 

Obrazek

Termální cykler pro syntézu DNA

 

Prakticky  byl používán  obecně doporučovaný  teplotní profil pro PCR jednoktokovou při schématu:

 

           1.  předehřátí  95 C po dobu 1 minuty

 

           35 krát opakovaný cyklus

 

           2. denaturace   94 C po dobu 1 minuty

 

           3. anniling  37-68 C po dobu 30 vteřin

 

           4. prodlužování 72 C po dobu 1minuty a 30 vteřin.

 

1. předehřátí 95 C 60 vteřin(15 min.) 1x
2. denaturace 94 C 60 vteřin 35x
3. anniling 37-68 C 30 vteřin 35x
4. prodlužování 72 C 90 vteřin 35x
5 závěrečné prodloužení 72 C 10 minut 1x

 

Od uvedeného obecného schématu  teplotního profilu reakce se liší  profil  PCR  s  horkým   startem  (HotStar),  kde  je  předehřátí  prodlouženo  na 15  minut.  Annilingová  teplota rozhoduje  o speificitě  produktu podle  dodržení vypočtené  teploty. Teplota  se vypočítává  podle poměru  obsahu párů  nukleotidových basí  A-C a  G-C a je určena pro ten který primer.

 

 

 

3.6.1.Identifikace produktu.

 

Produkt  vzniklý  v  reakční  směsi  za  přítomnosti specifických  primerů a při učeném teplotním režimu se rozdělí elektroforeticky na agarózovém gelu a po  obarvení ethidiumbromidem a po porovnání s velikostním   DNA   markrem    se   odečítá   v   procházejícím ultrafialovém světle.Produkt je  možné ještě verifikovat následnou hybridizací produktu, případně  jej podrobit analýze restrikčními enzymy.  

 

Koncentrace agarózového gelu se řídí podle velikosti produktu.Při produktu  s  velikostí  100-200  bp  je  koncentrace  2-3%  ní, u produktů  300-500 bp  je to  koncentrace 1,5  % ní, při velikosti kolem 1000  bp stačí koncentrace kolem  1%. Ethidium bromid 10mg% vodný roztok se přidává přímo  do rozpuštěného agarózového gelu v do finální koncentrace 0,1-0,5 ul/ml.Amplifikát se mísí v poměru 1:6 s 6x koncentrovaným vazebným roztokem, který   obsahuje bromfenolovou  modř(0,25%) xylen cyanol FF(0,25%),EDTU(6mM) a Ficoll 400 polymer (15%) pH 8,0. Vazebný roztok umožní sledovat  pohyb pro- duktů amplifikace (bromthymolová modř  putuje  v  oblasti  300  bp, xylen cyanol FF v oblasti 1000 bp)EDTA zastavuje  činnost  zbytků polymerázy  za nespecifické teploty a inhibuje produkt pro případnou kontaminaci  v  následných  PCR  stejnými  primery.  Ficcoll váže amplifikovanou DNA  a svoji vahou ji strhává na dno  jamky v gelu, výsledkem   pak  je   ostřejší  obrys   amplifikačního  bendu   v gelu. Elekroforéza  probíhá  v   Tris-EDTA-kys.octová  pufru  (TAE 1x:Tris base 40mM,kys.octová 40mM, EDTA 1mM)při pH  7,5  působením stejnosměrného elektrického proudu 90  V,(1-10 V/cm) 120 mA po dobu 60  minut.Agaróza  je rozpuštěna ve stejném pufru TAE (1x). Gel  s  produkty  po  proběhlé  elektroforéze  se  odečítá proti velikostnímu markru v ultrafialové oblasti světla (254 nm). Dokumentuje  se fotografováním  před červený  filtr na  černobílý negativní panchromatický film 30 vteřin při cloně 5,6-8.

 

 

 

 

 

 

HotStarTaqMaster Mix QIAGEN (ROCHE) 50,00 ul
primer + (50pmol/1ul) 1,00 ul
primer - (50pmol/1ul) 1,00 ul
templátová DNA

20,00 ul

destilovaná sterilní voda pro PCR 28,00 ul

 

 

 

 

 

Obrazek

Vzorky s pozitivní genomovou i plasmidovou DNA B.Burgdorferi